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高通量测序DNA样本建库方法(3):扩增法

2017-06-04 微微悦明 微微悦明

扩增法建库,是指利用PCR方法扩增特定的分子片段,并在扩增过程中引入接头和测序引物区域的建库方法。

其目前在微生物领域应用最广,主要应用在宏基因组测序,用于检测微生物群体的组成结构。主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。采用第二代高通量测序平台测定的16S/18S /ITS某个高变区域的序列,来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异,对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。


扩增子建库目前市场上一般不收费!不收费!不收费!(重要的事情说三遍)。

和机器打断法、转座酶法动辄每个样几百块钱的建库费用比起来,可以节省一大笔开销。


为啥不收费呢?

原理上说,扩增子建库的过程其实就是PCR过程,实验成本主要是酶和引物,相对成本较低。


其操作过程目前主要有2种流程选择(一步法建库和两步法建库)。

一步法建库是指通过一轮PCR反应,同时进行16S扩增和接头连接的工作,如下图a所示。

两步法建库是指通过两轮PCR反应,分别进行16S扩增以及接头连接的工作,如下图b所示。


原理上很简单,成本很便宜。

那么,是否扩增子建库就可以替代其他两种建库方法了呢?非也!


1、扩增子测序只能检测样本中某一或几个特定基因片段,而并非所有的基因。建库过程中经过了PCR富集和筛选,将研究者所感兴趣的片段几万几十万倍的放大。好处是,研究有针对性,有的放矢;缺点是,信息不全面,例如,只能检测样本中某种菌的有无,却不可能检测其耐药性或毒力。


2、扩增子建库过程中,受酶、扩增循环数等诸多因素的影响。最终检测的微生物群体组成和样本中真实状态会有一定的偏差。基本上,样本起始浓度越高,建库循环数越大,实验中采用的酶越便宜,实验结果与真实情况偏差越远。(关于这方面,感兴趣可以翻笔者之前的贴子“【好文共赏】一管窥豹,SOP标准化在宏基因组研究中的重要性”)


微微碎碎念: 扩增子测序适合进行宏基因组测序,例如粪便、痰液、土壤等。其成本较低,易于开展,值得注意的是,其结果极易受实验操作的影响,容易产生假阳性结果,因此,建议实验过程一定要注意标准化!

疾控系统人员可参照CDC高通量测序实验技术建议方案(2015版),详见”阅读原文“或与笔者联系。




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